새로운 직장에서 새로운 일을 하게 되었다.
전기생리학, patch recording을 할 줄 안다고 하기에는 매우 부족하게 느껴지나, 학위과정에서 제일 친숙하게 지냈던 것도 사실이다.
그랬는데 FACS를 배우게 되었다.
그래서 최근 이론 공부부터 하고 있는데 - 이미 잘 작성된 글들도 많지만 - 내가 기억 하기 위해서 블로그에 깔짝거려보기로 한다.
참고로 과학적인 용어보다도 내가 이해한걸 토대로 쓸 예정이기 때문에... 야매처럼 될 수 있다. 양해 부탁 드린다.
1. FACS? Flow cytometry?
학부시절, facs라고 하는 기기 친구에 대해서 배워본 적이 있긴 하다. 대애애충 형광을 감별하여 세포를 분류할 수 있다고...
맞다. Fluorescence activated cell sorting이 풀네임이다. 이름대로 풀자면 형광별로 활성화된 세포를 분류하겠다는 뜻으로 보인다.
그렇다면 flow cytometry는 무엇인가? facs와 비슷한데, 기본적으로 보면 flow cytometry가 먼저고, 형광별로 분류까지 해주는게 facs다. 세포를 droplet에 single cell이 되게끔 흘려보내 세포 하나하나를 분석하는 것이다.
그렇다면 flow cytometry를 먼저 이해해야겠네?
2. flow cytometry의 기본 원리.
그래서 찾아보니 이 flow cytometry의 기본 구성은 대ㅐㅐㅐ충 세가지 파트로 이뤄진다.
fluidics, optics, electronics 이렇게 구성된다.
각 파트들을 설명하기 전에, 간략하게 세 파트를 요약하면,
fluidics 는 세포를 fluid에 태워 분석(optics)을 할 수 있도록 하는 중요한 파트다.
optics, electronics는 우리가 관심있는 세포들에 붙어 있는(보고자 하는 항체를 붙인다. 여기에는 다양한 conjugates, 형광들이 붙어 있는 제품이 많다) 형광에 대한 정보를 얻어 분석하는 파트다.
이를 더 줄이면, 관심있는 물질(세포부터 심지어 DNA까지도)을 fluid에 흘려보내 세포에 붙은 항체(형광)로 내가 관심 있는 단백질의 양 등을 분석하는 것이 flow cytometry다.
사실 뭐... 나도 이 자료 저 자료 읽어가며 공부하고 내 멋대로 다시 정리한 것이라 깔끔하지 않다 ㅠ 이 부분은 나중에 다시 추가해보기로...
암튼 전부 다 다루면 좋겠지만, 일단 내가 생소한 부분부터 정리하고 있다. 그래서 형광 관련 부분은 간단하게만 하고 넘어갈 것이다..
3. fluidics 파트에서 뭐가 중요한데?
아직 실험을 해보지 않아서 모르겠다. 근데, 구조를 보면
그림 가운데 부분을 보면 sample이 흘러 내려오는 부분이 있고(정확하게는 압력을 줘서 움직이는 거다..) 그 양쪽에 sheath fluid가 있다. fludics 구조를 보면 크게 두가지던데, 하나는 volumeric injection 방법이고, 다른 하나이자 대부분은 differential pressure를 이용하는 방법을 사용한다고 한다. 다시 본론으로 돌아와서 sheath의 속도가 곧 fluid의 flow 속도가 된다. 그리고 flow cytometer의 중요한 포인트는 "single cell"이 되게끔 만들어 세포 하나하나의 형광을 분석하고자 함이 포인트다. 그러므로 세포가 뭉쳐있는 경우나 debris가 같이 있는 경우가 되어버리면 나중에 설명하겠지만 정확한 데이터를 얻을 수 없다. 때문에 하나하나 세포를 띠어주는 것이 중요한데... core stream size라는 것 있다. 그림을 개떡같이 그리긴 했는데, 단순히 생각했을때 저 core streeam size가 커지면 single cell이 아니라 여러 cell들이 같이 있을 것 같지 않은가? 반대로, 세포 크기에 적당히 잘 맞으면 물줄기 하나에 세포들이 일렬로 떨어질 것 같지 않은가?
이렇게 만들기 위해 우리는 sample에 가해지는 압력(속도)를 조절해야 한다고 한다(나도 안해봐서 아직 모른다ㅠ). sheath에 가해지는 압력과 sample에 가해지는 압력 차이를 differential pressure라고 하는데, 보통 sample의 loading 압력(속도)를 변화한다. 그럼에 따라서 차이가 작을수도, 커질 수도 있는데 일반적으로 sheath의 압력은 일정(constant)하게 한다. 그러면 sample이 변화함에 따라서 차이 압력이 낮거나 높아지는 것이다.
그래서 둘 간의 차이가 작으면 core stream size가 좁고, 차이가 크면 core stream size가 넓다. 잘 생각해보면 이해하기 쉽다.
아마 이걸 이용해서 single cell로 잘 나오게 만들지 않을까... 생각한다. 더 실질적인건 실험을 하면서 배우지 않을까?(무책임)
4. optics & electronics
12시가 다 되어가니 방전이 되어간다
Forward Scatter(FSC), Side Scatter(SSC) - FSC는 상대적인(절대값이 아니다!) 세포 크기, SSC는 역시 상대적인 과립정도, 복잡도 를 나타낸다.
부가적으로 A(Area), H(Height) - signal의 intensity를 나타낸다. signal intensity 그래프의 면적과 각 피크 값이지 않을까.. 생각하는데 공부 더 해오겠다. W(width)는 time이고. 이 개념들은 나중에 gating할때 live/dead 걸러낼 때나(no staining) doublet을 골라낼 때 사용하더라..
(잠깐 설명하면 세포가 레이저를 받아 형광이 산란되는 정도로 얘는 뭔가 하는 걸 분석하는데,)
형광에 대한 일반적인 내용은 생략한다. excitation과 emmission은 다들 아실테고..
filter는 총 세가지. LongPass, ShortPass, BandPass 세 가지다. LP 500이면 500이상 투과 나머지 반사, SP 500이면 500이하 투과 나머지 반사, BP 500/20 이면 500-20/500+20 사이 투과.
그래서 결국 그래프를 보면서 분석을 하게 되는데...
그전에 spillover와 compensation을 적절히 해야 내가 한 실험들의 데이터를 더 깔끔하게 만들 수 있다고 한다.
이건 다음시간에...
<미완성>