<FACS, flow cytometer> 뭘 어떻게 써야 하나...

FACS, 정확하게는 flow cytometer를 쓰면 당연히 분석을 해야한다.

 

음... 처음부터 빌드업을 다시 하면, 앞에서는 기본적인 FACS라고 불리우는 장비의 기초에 대해서 설명했는데,

 

이번에는 그 실전이다.

 

전체적인 흐름은 다음과 같다.

 

여느 antibody를 이용하는 실험처럼, 세포를 잘 키운 후 목적에 맞게 잘 요리(?)한 후, 보려고 하는 단백질 등에 항체-형광물질을 붙여 염색한다. 그리고 그 세포를 잡아 유세포분석기를 이용해 내가 생각하는 cell population에서 특정 단백질의 발현이 어떻게 되는지 확인한다. 근데... 형광이란게 다 좋은데 한번에 여러 단백질을 분석하기 위해 각각 다른 파장대의 형광을 사용할 경우 결국에는 서로의 emission 파장대가 겹치기도 하는 등 여러 문제가 발생해 내가 보고싶은 단백질 발현을 보고 있는게 맞는지 의구심이 들게 한다.

 

그래서 컨트롤 실험이 아주 중요하다. 여러개의 항체를 이용할 경우 positive control로 한 항체의 단독 염색한 컨트롤군이 있어야한다. 가령 CD3, CD4, CD8을 lymphocytes에 염색을 한다고 하면, CD3만 staining한 컨트롤이 필요하다는 것이다.

 

특히 두 개 이상의 형광물질을 쓰는 경우 특히 조심해야한다. 나는 FITC쪽 형광을 보기 위해 레이저를 세팅했는데, 다른 디텍터에서 FITC에서 발생된 신호가 잡힐 수도 있다. 따라서 각 facs 기기 제조사나 항체 제조사에서 제공하는 spectral viewer를 통해 내가 샘플에 사용할 항체의 형광물질이 가지는 스펙트럼이 최대한 겹치지 않게 사용하는 것이 좋다. 하지만 4개 이상 쓰게 되면 어쩔 수 없이 겹치게 되는데, facs 장비에서 제공하는 compensation을 최대한 이용해서 각 detector에 다른 형광물질의 signal을 최소화 해야 한다. 이는 flowjo 등 분석프로그램에서도 사용할 수 있다.

 

는 말은 쉽게 했는데, 나도 아직 compensation 부분에 대해서는 지식과 실험 경험이 부족하여 배우고 있다 ㅠ

 

조금 더 익숙해지면 compensation 파트는 다시 정리해보려고 한다.

 

아참, 실험과 관련해서는 브릭에 올라와있는 면역학 기초실험에 대해 작성한 연재글이 있는데, 읽어보는걸 추천한다.